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微衛星不穩定（MSI）檢測試劑盒產品說明書 

（PCR-毛細管電泳法）

前言

  微衛星(Microsatellite)是遍布于人類基因組中的短串聯重復序列。與正常組織相比，腫瘤組織的微衛星由于重復單位的插入或缺失而導致微衛星長度的改變，就叫做微衛星不穩定性(Microsatellite Instability，MSI)。研究表明，MSI是由錯配修復(MMR)基因發生缺陷引起的，與腫瘤的發生密切相關。臨床上已將MSI作為結直腸癌預后和制定輔助治療方案的重要分子標志物，并應用于協助Lynch綜合征篩查。

產品介紹

  本試劑盒采用多重熒光PCR的方法對檢測位點進行擴增，通過毛細管電泳對擴增產物進行檢測，并利用分析軟件進行結果分析。其主要優點是檢測準確全面、操作簡單快捷、結果直觀易讀等。

檢測位點

  Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27

產品編號

  P600-S（16人份/盒）

儲存條件及有效期

  1.收到干冰或冰袋冷凍運輸的試劑盒后，如暫時不用，請置于-20±5℃長期保存。  

  2.有效期：-20℃保存12個月，如開啟使用，盡量避免反復凍融，試劑盒反復凍融 5 次內有效，開瓶兩個月內有效。 

擴增前試劑盒

擴增后試劑盒

實驗所需主要儀器設備

      PCR 擴增儀、ABI 毛細管電泳儀（3500、3730 等）、96 孔板式離心機、潔凈工作臺、微量移液器、 冰箱等。 

試劑盒使用方法（試劑使用前請輕微振蕩，并短暫離心）

1、基因組 DNA 準備

  請使用全基因組DNA提取試劑盒對待檢樣品進行全基因組DNA進行提取。例如：廣州艾基生物技術有限公司： iPure 細胞/血液/動物組織gDNA提取試劑盒（K316-L）等試劑盒。

2、PCR 擴增

      2.1 PCR 反應 PCR 反應體系（PCR 反應液現配現用，若配制多余可-20℃保存一周，勿反復凍融。）

      2.2 PCR 程序

  備注：因各地PCR儀性能不同，循環參數中的退火溫度可適當調整，調整范圍±2℃內。亦可根據模板DNA量和檢測信號強度來調整熱循環次數。

3、毛細管電泳檢測

  將PCR擴增產物3000rpm離心1分鐘，取1μL PCR擴增產物與1μL LIZ-500和9 μL去離子甲酰胺（去離子甲酰胺需要自備）混合，將96孔板離心后進行毛細管電泳檢測。

4、數據分析

  1. 導入panel和bin之后，使用GeneMapper對原始數據進行分析，根據微衛星不穩定評判標準對結果進行判斷。(Panel,bin文件請聯系公司索取。)

  2.判斷標準：

   （1）高度不穩定（MSI-H）：5個分子標記中含有2個或以上出現變異。

   （2）低度不穩定（MSI-L）：5個分子標記中只有1個出現變異。

   （3）微衛星穩定（MSS）：  5個分子標記中未出現變異。

  3.峰圖實例：

圖1：高度不穩定（MSI-H）

圖2：微衛星穩定（MSS）

樣本要求

   樣本類型：人 EDTA 抗凝全血。 

   樣本保存：血液樣本一經采集應盡快送檢；或-20℃±5℃保存，24 個月內檢測。基因組 DNA 一經提取應盡快檢測；或 2~8℃保存，4 周內檢測；或-20℃±5℃保存，24 個月內檢測， 凍融不超過 5 次。 

樣本DNA質量要求：DNA 應保證 OD260/OD280在 1.6~2.0 之間，濃度≥10 ng/μL。

注意事項

   1.請在使用前仔細閱讀產品說明書。 

   2. 實驗室應具備合理的生物安全防備設施和防護程序，實驗室管理應嚴格按照 PCR 實驗 室的管理規范，實驗操作人員應具備基因擴增等相關實驗操作資格。PCR 相關操作應嚴格 按照國家有關規定進行嚴格分區。實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段 用品不能交叉使用，防止核酸的交叉污染。 

   3. 實驗中使用的離心管、吸頭，應無菌及無核酸酶。 

   4. 實驗過程中需穿戴防護衣物、一次性手套、口罩。 

   5. 檢測過程中剩余的樣品、PCR 擴增產物及污染的試劑和耗材等，需按相關法規條例來消 毒和處理。 

   6. 在有效期內使用試劑盒，不同批號的試劑切勿混用。 

   7. 酶混合液相關操作應在冰上進行。其他試劑使用前應完全解凍并混合均勻，盡量避免反 復凍融。 

   8.加樣時，所有液體都要緩慢加至管底，不要殘留在管壁上，不能用手直接觸摸 PCR 管管蓋。

   9.若樣本存在質量問題時，如嚴重降解或含有 PCR 抑制劑等，檢測結果可能出現雜峰或 目的擴增產物丟失，影響結果判斷。

參考文獻

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